上篇我們認(rèn)識qPCR，對比PCR之間區(qū)別，知道qPCR，你應(yīng)該接觸到染料法PCR和熒光探針法PCR。它們都屬于qPCR（實時定量PCR技術(shù)）。今天，主要講下探針法PCR工作原理，對探針法PCR有個全面的認(rèn)識。關(guān)于qPCR，可以參考《qPCR：實時定量 PCR 技術(shù)》

  什么是探針法PCR?

  探針法的qPCR是一種PCR方法，它使用熒光標(biāo)記的序列特異性DNA寡核苷酸（稱為探針）來獲得非常準(zhǔn)確和特異的結(jié)果。使用探針不僅需要設(shè)計引物，還需要設(shè)計探針（下文有介紹），這可能會使實驗比使用基于染料的qPCR更加耗時和昂貴。

  探針法PCR是如何工作？

  再開始使用探針的qPCR，您需要的探針在其一端包含熒光報告染料，在另一側(cè)包含猝滅元件，通過吸收報告基因發(fā)出的光來防止熒光。熒光報告染料和猝滅劑的位置彼此靠近，以便猝滅劑阻止熒光。在設(shè)計引物和探針時考慮引物和探針的位置也很重要。探針應(yīng)位于序列中間的引物之間。在PCR過程中，探針定位引物下游并與互補靶標(biāo)結(jié)合。然后，熒光報告染料和猝滅劑被TaqDNA聚合酶分離，該酶會裂解探針。這使得熒光信號被釋放，qPCR機器將測量該信號，然后用于定量樣品中的DNA量。（圖1）

圖1 TaqMan 探針法原理示意圖

  這種方法的好處是您可以確定信號來自預(yù)期目標(biāo)，因為只有引物和探針與正確的序列結(jié)合時您才能獲得信號。前提是探針和引物設(shè)計良好并且不會非特異性地結(jié)合到其他地方。

  除了更高的特異性（與基于染料的qPCR相比）之外，基于探針的qPCR還可以節(jié)省反應(yīng)完成后分析qPCR結(jié)果的時間，因為您不需要弄清楚您正在查看的是否正確目標(biāo)放大與否。由于探針的特異性，如果您沒有大量目標(biāo)材料或想要檢測目標(biāo)中的微小變化（如SNP（單核苷酸多態(tài)性）），它們也很有用。

  如前所述，基于探針的qPCR可用于多重檢測。這意味著通過使用攜帶不同報告染料的不同標(biāo)記探針可以在單個反應(yīng)中檢測多個序列。由于在不同通道中檢測到不同的熒光團，因此稍后可以區(qū)分哪一個目標(biāo)被擴增。與使用單重分析相比，這可以使實驗更快、更便宜。盡管如此，重要的是要記住在混合物中添加更多的反應(yīng)組分或使用專為多重檢測而設(shè)計的指定試劑，這樣就不會出現(xiàn)競爭，從而限制一個或多個目標(biāo)的擴增。

  如何設(shè)計探針？

  探針法PCR最困難的部分可能是設(shè)計探針。一旦完成，其他一切實際上與基于染料的qPCR（后期要討論的）沒有什么不同。

  當(dāng)開始設(shè)計探針時，明智的做法是同時記住引物，以避免自我互補并確保其對靶標(biāo)的特異性。運行BLAST比對很可能會對此有所幫助。您還可以嘗試其他軟件，如SnapGene、Benchling等。探針的位置應(yīng)靠近引物（約50bp），但不能重疊。應(yīng)以中等量（~50%）的GC含量為目標(biāo)，以允許復(fù)雜性，同時保持獨特的序列。此外，探針不應(yīng)太長（~30bp），否則將難以正確猝滅熒光。探針的熔解溫度應(yīng)略高于引物(8-10°C)，以確保更好的靈敏度。在循環(huán)程序中，退火溫度應(yīng)設(shè)置為比引物熔解溫度下限低最多5°C，以實現(xiàn)特異性結(jié)合。大多數(shù)探針設(shè)計程序也會告訴您要記住這些建議，但根據(jù)實驗的不同，可能需要進行優(yōu)化。

  在計劃多重實驗時，設(shè)計帶有報告熒光團的探針非常重要，這些熒光團具有足夠不同的激發(fā)和發(fā)射波長，以便qPCR機器可以區(qū)分它們。猝滅劑還必須與報告基因相匹配。此外，請確保您的qPCR機器實際上能夠讀取所有熒光團信號，以及您是否擁有無ROX、高ROX或低ROX機器。

最后您應(yīng)該知道qPCR有不同的探針變體，這些變體也有變體，這些變體有修改，所以確實有很多選項可供選擇。最流行的是水解探針（例如TaqMan®），它們有利于定量和多重分析。然后還有分子信標(biāo)，它們被認(rèn)為更具特異性，可用于SNP檢測等。

上述是探針法 PCR 工作原理詳解，內(nèi)容比較多和抽象，大家看完文章后可以對照自己的實驗進行操作，通過實驗加深原理的理解。如果對探針法PCR還有疑問，可以尋求在線技術(shù)顧問幫助。如果您想了解更多探針法PCR試劑盒，歡迎前來咨詢。